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这幅最为世人熟知的画，2003年之前长期展挂在卢浮宫德农翼厅的百邦展室。尔后迁到更大的展间，以满足巨量游客一饱眼福的愿望。根据传言，列昂纳多花了十年的时间来画她的双唇。该画是惟一无人质疑出自列昂纳多之手的作品，虽然上面既无签名又无日期。它有不止一个名字。法国人和意大利人用不同的词汇把它称作“轻忧寡怨的女人”。它看来是列昂纳多的心爱之作，所以他才像丹·布朗所说的那样“所到之处随身携带”。自然或许另有原因：画作尚未完成。
该画用油彩绘制在白杨木板上，最先被法兰西王用4000金币买下。法国革命后，画作被转送给卢浮宫艺术博物馆。拿破仑取走了它并一直把它悬挂在卧室之内，他被流放之后该画才归还卢浮宫。原来这幅画比现在大出许多，最初的框架上带着两根支柱，表明画被摆放在高台上。
丹·布朗的见解引人入胜：蒙娜丽莎是“阿蒙·丽莎”的拆拼重组，藉此开创女性与男性的结合。但倘若如此，它也可同样组成“莎勒（和）阿尼玛”——太阳与灵魂，牵涉到君士坦丁大帝罗马时代的主要宗教之一——“无敌的太阳”的拜日教，而基督教的许多习俗惯例都自此承袭而来。蒙娜丽莎的身份也有数说可选：丹·布朗暗指列昂纳多本人男扮女装，甚至可能真有其事。电脑图像分析揭示，蒙娜丽莎和列昂纳多一张自画像，面部特征之间关联紧密。然而，舆论广泛认为该画是他受雇于吉奥康多的弗朗西斯柯·巴托罗密欧，为其夫人丽莎所作的肖像。
微笑背后的原因，要寻根究底也同样扑朔迷离。意大利的一位医生认为，她身有疾患——睡眠中或抑郁时会咬磨牙齿。列昂纳多总是能使他的模特感到高兴，因而她心怀抑郁的可能微乎其微。他曾经聘雇六位乐师，还畜养了一只波斯猫和一头灵来作陪伴。当时采用这种微笑的既有列昂纳多，也有其他画师，包括他的授业恩师维罗齐奥。
有些人觉得该画“平庸乏味”，但列昂纳多在创作风格上却有新的探索。《蒙娜丽莎》与同时期的其他画作迥然不同的是，她没戴任何首饰。列昂纳多又破除惯例，让她显得轻松自在，超越了传统僵直正经的坐姿。
使景物如罩轻烟的晕染法(《达·芬奇密码》中索菲·奈芙所说的“飘逸而朦胧”)，是列昂纳多画作的主要特点之一。这是他表达“历经自然”的特殊手法。丹·布朗在书中指出，画中乡村景物的地平线高低有别，左手侧低于右手侧。依据某些解释，这是列昂纳多强调客观存在阴柔较暗的一面。画中右手侧有处池塘，高出了左侧流淌的小溪。就我们所知来说，蒙娜丽莎的脑后应该有道瀑布，它充满池塘流入小溪。似乎不应再有更多的诠释。
正如丹·布朗所说，该画1911年被盗。窃贼是意大利人，将画带回了意大利。案发24小时后当局才知大事不妙，原本以为是馆内的专职摄影师挪走了画。随后花了一周时间搜遍卢浮宫，找到的只有丢弃在楼梯上的画框。两年后，窃贼文钦佐·佩卢夏要价10万美金将画卖给乌菲兹艺术馆，归还巴黎之前画作曾在该馆展出。
为了盗画，佩卢夏藏身于一间小屋内等到闭馆，然后走进悬挂蒙娜丽莎的展室。他从墙上取下画，并割掉外框。为了逃出博物馆一道按常规锁闭的门，他只好旋下固定门钮的螺丝。佩卢夏曾在卢浮宫上班，负责为画作覆盖玻璃，因此非常熟悉馆内的布局。
1956年，有个神思昏聩的游客把酸液洒上画面，修复花费了数年时间。画作最后一次离馆是在1974年，前往日本展出。为了报答此番盛情，日本向卢浮宫赠送三叠加固的特种玻璃，至今将画作覆护在防弹匣内。该画不再离宫，这一点已经达成共识，因为各种风险实在难以承受。藏画环境温湿恒定，温度为摄氏20度，湿度为55%。防护层内装有空调器和9磅硅胶，确保空气条件不变。匣体每年开启一次，检查画的状况并维护空调系统。无人敢于清洁画面，恐怕引起损坏。积尘下的油光画彩，肯定比我们看到的远为鲜亮。
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