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汉明帝(公元58—75年)时期，东汉国力恢复起来，派出四路大军出塞，大败北匈奴，再次打开了深入西域的大门。并重新设置了西域都护府。在对匈奴的激战中，身为假(代)司马的班超智勇双全，崭露头角。他率领一支偏师，出击伊吾(今哈密附近)、大战蒲类海(巴里坤湖)，屡立战功。战后，他又奉命出使西域南道诸国，争取他们与匈奴决裂，通好东汉。
班超率36名随从，首先抵达鄯善。鄯善王对班超使团开始非常热情，不久却突然冷淡下来。原来是匈奴使者也到达鄯善活动，使鄯善王处于两强之间，莫知所从。班超得知这一情况后，当机立断，夜袭匈奴使团，一举而歼。这次果断的行动，促使鄯善王下决心断绝同匈奴的关系，重新和东汉交好。此后，班超一行西抵于阗。争取于阗王攻杀了匈奴派驻那里进行监督的使者。第二年，班超从小路疾进，到达疏勒，废黜了匈奴所立的疏勒王，重新扶立被匈奴杀掉的原疏勒王的儿子，因而大获疏勒民心。公元75年，朝廷召班超回朝。疏勒举国忧恐，一再挽留班超，当班超东归途中走到于阗，于阗王侯和民众遮道阻拦，甚至抱住班超的马腿哭泣，请求他留下。班超终于顺应民情，答应留下，并返回疏勒。此后，在敌强我弱的不利形势下，班超依靠同汉朝交好的于阗、疏勒等国，及东汉朝廷派去的千余援兵，迫降了匈奴在南道上的属国莎车，击败了龟兹援军，使西域南道得以畅通。公元89—91年，汉将窦宪大败匈奴，西域形势好转。班超在这一时期成功地击退了大月氏贵霜王朝的七万大军。西域北道的龟兹降于班超。东汉朝廷任命班超为西域都护，驻守龟兹。到公元94年，焉耆等国都恢复通好于东汉，西域北道也终于再次畅通。班超壮年出使，70岁才返回洛阳。他的儿子班勇继承父业，继续在西域服务。班超父子在西域的活动，保证了陆路丝道的畅通，为进一步沟通中西文化交流作出了不可磨灭的贡献。
东汉时期，丝绸之路的南道基本上同西汉时一样。北道的路线则有所变迁。出玉门关后，改经伊吾(今哈密)、高昌(今吐鲁番东南)，由此向西，沿天山南麓经龟兹、至疏勒，再向西越过葱岭，到大宛、康居、奄蔡诸国。由高昌向北，通往车师后王国金满城(今新疆吉木萨尔北)。东汉王朝在沿途设置驿亭，以方便商旅，并在鄯善北、伊吾、高昌、柳中(今吐鲁番南)，以及车师后王国的侯城、龟兹、疏勒等地大规模屯田。
特别要提到的是：公元97年，班超打算直接同大秦(罗马帝国)建立联络，特地派遣自己的助手甘英前往那个闻名已久的西方大国。甘英取道条支，直到波斯湾头。正当他“临大海欲渡”(《后汉书》卷一一八《西域传》)的时候，受到了安息西界海商的劝阻。他们告诉甘英说，大海无边，遇到顺风也要三个月才能渡过；若风不顺，则要走两年。因此渡海者需备三年口粮。此外，航行中死亡的事也时时发生。甘英终于望洋兴叹，止步不前。此时的安息，在中国与罗马帝国之间的经济、文化交流中，正是居中转口的地位。为了维护自己中间商的特殊地位，安息商人才那样千方百计地阻挠甘英的西进。终两汉时期，中国向西开发的丝绸之路，其陆路直接伸延的极限，有文字记载的，就是甘英所到的波斯湾头。
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